Spider-Man setzt dort an, wo der gleichnamige erfolgreiche Kinofilm endete. Die Serie begleitet die Abenteuer des Superhelden Peter Parker und seiner Freunde Harry Osborne und Mary Jane Watson während ihres ersten Studienjahres an der Empire State University. Parker muss akademische Verpflichtungen, einen Job als Webdesigner/Fotograf für den Daily Bugle und eine auf und ab gehende Beziehung zur Liebe seines Lebens unter einen Hut bringen, während er gleichzeitig darum kämpft, die Welt vor Superschurken zu beschützen.