Em busca do amor verdadeiro, Kanako Miyamae se transfere para o colégio católico Ame no Kisaki, inspirada pela forma como seus pais se apaixonaram ali. Há apenas uma diferença, porém: como homens causam urticária em Kanako, ela na verdade veio para a escola só de garotas para encontrar uma parceira do mesmo sexo. Quando ela conhece a bela Mariya Shidou, Kanako acredita ter encontrado alguém especial; no entanto, há mais em Mariya do que aparenta — descobre-se que o primeiro amor de Kanako é, na verdade, um garoto que se veste de mulher. Mariya ameaça expor as intenções impuras de Kanako a menos que ela mantenha seu verdadeiro gênero em segredo e, para piorar, ele também substitui sua colega de quarto original para poder vigiá-la de perto. Maria†Holic acompanha Kanako enquanto ela procura amor nos lugares errados e busca a garota dos seus sonhos — isso, se ela conseguir sobreviver sendo colega de quarto de Mariya!