Mencari cinta sejati, Kanako Miyamae pindah ke sekolah Katolik Ame no Kisaki, terinspirasi oleh bagaimana orang tuanya jatuh cinta di sana. Namun, ada satu perbedaan: karena pria membuat Kanako menderita gatal-gatal, ia sebenarnya datang ke sekolah khusus perempuan ini untuk mencari pasangan sesama jenis. Ketika ia bertemu dengan Mariya Shidou yang cantik, Kanako percaya ia telah menemukan orang spesial itu; namun, ada lebih banyak hal tentang Mariya daripada yang terlihat—ternyata cinta pertama Kanako sebenarnya adalah seorang anak laki-laki yang berdandan seperti perempuan. Mariya mengancam akan membongkar niat Kanako yang tidak murni kecuali ia merahasiakan jenis kelamin aslinya, dan yang lebih buruk lagi, ia juga menggantikan teman sekamar aslinya agar ia bisa mengawasinya dengan dekat. Maria†Holic mengikuti Kanako saat ia mencari cinta di tempat yang salah dan mencari gadis impiannya—itu pun jika ia bisa bertahan menjadi teman sekamar Mariya!