Neil Patrick Harris incarne Billy, alias Dr. Horrible, un super-vilain en herbe dont les plans de domination mondiale tournent constamment mal. Ses deux objectifs : être accepté dans la Ligue du Mal, et trouver le courage de parler à sa crush de la laverie, Penny, interprétée par Felicia Day. La seule chose qui se dresse sur son chemin est le Capitaine Hammer, l'arch-némésis super-héros de Billy, joué par Nathan Fillion. Avec un coup de maître, Billy pourrait entrer dans la L.D.M. et gagner le respect de Penny, mais seulement s'il parvient à la tenir éloignée du séduisant Capitaine Hammer...