En busca del amor verdadero, Kanako Miyamae se transfiere a la escuela católica Ame no Kisaki, inspirada por cómo sus padres se enamoraron allí. Sin embargo, hay una diferencia: como los hombres le provocan urticaria a Kanako, en realidad ha venido a la escuela solo para chicas para encontrar una pareja del mismo sexo. Cuando conoce a la hermosa Mariya Shidou, Kanako cree haber encontrado a esa persona especial; sin embargo, Mariya esconde más de lo que aparenta: resulta que el primer amor de Kanako es en realidad un chico que se viste de mujer. Mariya amenaza con exponer las intenciones impuras de Kanako a menos que ella mantenga en secreto su verdadero género, y para empeorar las cosas, también reemplaza a su compañera de cuarto original para poder vigilarla de cerca. Maria†Holic sigue a Kanako mientras busca el amor en los lugares equivocados y anhela a la chica de sus sueños, ¡si es que puede sobrevivir siendo la compañera de cuarto de Mariya!